Oxirgi ketma-ketlikdagi profil - End-sequence profiling

Oxirgi ketma-ketlikni profillash (ESP) (ba'zida "Paired-end mapping (PEM)") - bu osonlashtirish uchun ishlab chiqilgan ketma-ketlikdagi ulagichlarga asoslangan usul de novo yuqori aniqlikdagi nusxa ko'chirish raqamini va shunga o'xshash strukturaviy aberatsiyalarni aniqlash uchun genomlarni ketma-ketligi inversiyalar va translokatsiyalar.

Oxirgi ketma-ketlik profilining ish oqimi

Qisqacha aytganda, maqsadli genomik DNK izolyatsiya qilinadi va qisman restraktiv fermentlar bilan katta bo'laklarga hazm qilinadi. Hajmi-fraktsiyasidan so'ng, parchalar plazmidalarga klonlanib, sun'iy xromosomalarni qurish mumkin bakterial sun'iy xromosomalar (BAC) keyinchalik ular ketma-ketlikda va mos yozuvlar genomiga solishtiriladi. Tuzilgan xromosomalar va mos yozuvlar genomi o'rtasidagi yo'nalish va uzunlik o'zgarishini o'z ichiga olgan farqlar nusxa ko'chirish raqami va tizimli aberratsiyani taklif qiladi.

Sun'iy xromosoma qurilishi

Sun'iy xromosoma qurilishining bakteriyalar oqimi

Maqsadli genomning strukturaviy aberratsiyasini va nusxa ko'chirish sonining o'zgarishini (CNV) ESP bilan tahlil qilishdan oldin, maqsadli genom odatda ko'paytiriladi va sun'iy xromosoma qurilishi bilan saqlanib qoladi. Sun'iy xromosoma qurish uchun klassik strategiya bakterial sun'iy xromosoma (BAC). Asosan, maqsadli xromosoma tasodifiy hazm qilinadi va bakteriyalarga aylanib, klonlangan plazmidalarga kiritiladi.[1] Qo'shilgan qismlarning hajmi 150-350 kb.[2] Boshqa keng tarqalgan sun'iy xromosoma fosmiddir. BAC va fosmidlarning farqi kiritilgan DNKning kattaligidir. Fosmidlar faqat 40 kb DNK fragmentlarini o'z ichiga oladi,[3] bu aniqroq to'xtash nuqtasini aniqlashga imkon beradi.

Strukturaviy aberratsiyani aniqlash

Tugatish ketma-ketligini profillash (ESP) qo'shimchalar, o'chirishlar va xromosomalarni qayta tashkil etish kabi tizimli o'zgarishlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin. Xromosoma anormalliklarini ko'rib chiqadigan boshqa usullar bilan taqqoslang, ESP nusxa ko'chirish neytral anormalliklarini aniqlash uchun juda foydalidir, masalan, nusxa ko'chirish raqamlari o'zgarishini ko'rib chiqishda ko'rinmaydigan inversiyalar va translokatsiyalar.[4][5] BAC kutubxonasidan kiritilgan fragmentlarning ikkala uchi ham ketma-ketlik platformasi yordamida tartiblanadi. Variatsiyalarni aniqlash keyinchalik yo'naltirilgan genomga ketma-ket o'qilganlarni xaritalash orqali amalga oshiriladi.

Inversiya va translokatsiya

Inversiyalar va translokatsiyalarni yaroqsiz ketma-ketlik juftligi aniqlash osonroq. Masalan, juft uchlari mos yozuvlar genomidagi turli xil xromosomalarga joylashtirilgan bo'lsa, translokatsiyani aniqlash mumkin.[4][5] Inversiyani o'qlarning divergent yo'nalishi bo'yicha aniqlash mumkin, bu erda qo'shimchada ikkita ortiqcha yoki ikkita minus uchi bo'ladi.

ESP tomonidan aniqlangan xromosomalarning qayta tuzilishi

Kiritish va o'chirish

Qo'shish yoki o'chirish holatida, juftlashtirilgan uchini xaritalash mos yozuvlar genomiga mos keladi. Ammo o'qish hajmi aniq bir-biriga mos kelmaydi. Ko'rinib turgan o'lcham - bu mos yozuvlar genomida tasvirlangan BAC ketma-ket uchlari masofasi. Agar BAC uzunlik qo'shimchasiga ega bo'lsa (l), mos keladigan xaritalashda mos yozuvlar genomida o'lcham (l) bo'lagi ko'rsatiladi. Agar juft uchlari masofadan (l) yaqinroq bo'lsa, namuna olingan DNKga qo'shilish shubha ostiga olinadi. Qo'shimchani aniqlash uchun (l [5][6] Yo'q qilishda, kutilgan masofaga nisbatan (l> m-3σ) juftlangan uchlar mos yozuvlar genomida uzoqroq xaritada joylashtiriladi.[6]

Raqamlarning o'zgarishini nusxalash

ESP tomonidan aniqlangan raqam o'zgarishlarini nusxalash

Ba'zi hollarda, kelishmovchiliklar o'qishni ham ko'rsatishi mumkin CNV masalan, ketma-ketlikda takrorlanadi. Kattaroq CNV uchun o'qishlar zichligi nusxa ko'chirish raqamiga qarab o'zgaradi. Nusxa sonlarining ko'payishi, xuddi shu mintaqani mos yozuvlar genomidagi xaritalarini ko'paytirish orqali aks etadi.

ESP tarixi

ESP birinchi bo'lib 2003 yilda doktor Kollinz va uning Kaliforniya shtatidagi San-Frantsiskodagi hamkasblari tomonidan ishlab chiqilgan va nashr etilgan. Ularning tadqiqotlari MCF7 inson saraton hujayralarining xromosomalarini qayta tashkil etishini va CNV ni 150kb aniqlikda aniqladi, bu o'sha paytdagi CGH va spektral kariotiplash bilan taqqoslaganda ancha aniq.[5] 2007 yilda doktor Snayder va uning guruhi ESP-ni 3kb piksellar sonini yaxshilab, BK konstruksiyasiz 3-kb DNK fragmentlarining ikkala juftligini ketma-ket ravishda ajratdilar. Ularning yondashuvi o'chirish, teskari yo'naltirish va qo'shimchalarni aniqlashga qodir, bu o'rtacha 644 ot kuchiga teng, bu esa polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR).[7]

ESP dasturlari

Oxirgi ketma-ketlikdagi profilni tahlil qilish uchun turli xil bioinformatik vositalardan foydalanish mumkin. Odatda, BreakDancer, PEMer, Variation Hunter, keng tarqalgan LAW, GASV va Spanner kiradi.[8] ESP kasallik to'qimalarida yuqori aniqlikda tizimli o'zgarishni xaritalash uchun ishlatilishi mumkin. Ushbu uslub asosan turli xil saraton turlaridan o'sma namunalarida qo'llaniladi. Kopiya neytral xromosoma anormalliklarini aniq aniqlash, ayniqsa, translokatsiya birlashma oqsillariga, ximerik oqsillarga yoki o'smalarda ko'rish mumkin bo'lgan noto'g'ri tartibga solingan oqsillarga olib kelishi mumkinligi sababli juda muhimdir. Ushbu uslub evolyutsiya tadqiqotlarida turli populyatsiyalar o'rtasida katta tarkibiy o'zgarishni aniqlash orqali ham qo'llanilishi mumkin.[9] Shunga o'xshash usullar turli xil ilovalar uchun ishlab chiqilmoqda. Masalan, 16S V6 yorlig'ini sekanslash orqali mikroblarning xilma-xilligini baholash uchun shtrix-kodli Illumina juft-juft ketma-ketligi (BIPES) yondashuvidan foydalanildi.[10]

Afzalliklar va cheklovlar

ESP tomonidan struktura o'zgarishini aniqlashning rezolyutsiyasi PCR bilan bir xil darajaga ko'tarildi va yanada teng o'lchamdagi DNK fragmentlarini tanlash orqali yanada yaxshilanishi mumkin. ESP qurilgan sun'iy xromosoma bilan yoki bo'lmasdan qo'llanilishi mumkin. BAC yordamida qimmatbaho namunalar abadiylashtirilishi va saqlanib qolishi mumkin, bu keng ko'lamli tahlillar uchun rejalashtirilgan mayda mayda moddalar uchun juda muhimdir. Bundan tashqari, qayta tashkil etilgan DNK fragmentlarini tashiydigan BAClar bevosita transfektsiya qilinishi mumkin in vitro yoki jonli ravishda ushbu kelishuvlar funktsiyasini tahlil qilish. Biroq, BAC qurilishi hali ham qimmat va ko'p mehnat talab qiladi. Tadqiqotchilar aniq loyiha uchun qanday strategiya kerakligini tanlashda juda ehtiyot bo'lishlari kerak. ESP faqat qisqa juftlashtirilgan ketma-ketliklarni ko'rib chiqqanligi sababli, keng miqyosli sekanslash kerak bo'lmasdan genom bo'yicha foydali ma'lumotlarni taqdim etishning afzalligi bor. Butun genomni sekvensiya qilish bilan taqqoslaganda taxminan 100-200 ta o'simtani 150kb dan yuqori rezolyutsiyada tartiblash mumkin.

Adabiyotlar

  1. ^ O'Konnor, M; Peifer, M; Bender, V (16 iyun 1989). "Escherichia coli-da katta DNK segmentlarini qurish". Ilm-fan. 244 (4910): 1307–12. Bibcode:1989 yil ... 244.1307O. doi:10.1126 / science.2660262. PMID  2660262.
  2. ^ Stone, NE; Fan, JB; Willour, V; Pennakxio, Kaliforniya; Warrington, JA; Xu, A; de la Shapelle, A; Lehesjoki, AE; Koks, DR; Myers, RM (1996 yil mart). "Progressiv mioklonus epilepsiya genini o'z ichiga olgan inson xromosomasi 21 hududida 750 kb bakterial klon kontigini va cheklash xaritasini qurish". Genom tadqiqotlari. 6 (3): 218–25. doi:10.1101 / gr.6.3.218. PMID  8963899.
  3. ^ Tuzun, Eray; O'tkir, Endryu J; Beyli, Jefri A; Kaul, Rajinder; Morrison, V Anne; Pertz, Liza M; Xagen, Erik; Xeyden, Xillari; Albertson, Donna; Pinkel, Doniyor; Olson, Maynard V; Eichler, Evan E (2005 yil 15-may). "Inson genomining ingichka miqyosdagi tarkibiy o'zgarishi". Tabiat genetikasi. 37 (7): 727–732. doi:10.1038 / ng1562. PMID  15895083.
  4. ^ a b Bashir, Ali; Volik, Stanislav; Kollinz, Kolin; Bafna, Vineet; Rafael, Benjamin J.; Ouzounis, Christos A. (2008 yil 25-aprel). "Saraton kasalligida genomning qayta tuzilishini aniqlash uchun juft-juft ketma-ketlik strategiyasini baholash". PLOS hisoblash biologiyasi. 4 (4): e1000051. Bibcode:2008PLSCB ... 4E0051B. doi:10.1371 / journal.pcbi.1000051. PMC  2278375. PMID  18404202.
  5. ^ a b v d Volik, S .; Chjao, S .; Chin, K .; Brebner, J. H .; Xerndon, D. R .; Tao, Q .; Kovbel, D.; Xuang, G.; Lapuk, A .; Kuo, V.-L .; Magrane, G.; de Yong, P .; Grey, J. V .; Kollinz, C. (2003 yil 4-iyun). "Oxirgi ketma-ketlikni profillash: aberrant genomlarning ketma-ketligi asosida tahlil qilish". Milliy fanlar akademiyasi materiallari. 100 (13): 7696–7701. Bibcode:2003PNAS..100.7696V. doi:10.1073 / pnas.1232418100. PMC  164650. PMID  12788976.
  6. ^ a b Yang, R; Chen, L; Nyuman, S; Gandi, K; Doho, G; Moreno, CS; Vertino, Bosh vazir; Bernal-Mizarchi, L; Lonial, S; Boise, LH; Rossi, M; Kovalski, J; Qin, ZS (2014). "Ko'p miyelomadagi genomik strukturaviy o'zgarishlarni aniqlash uchun butun-genomning juftlashgan va juft-juft ketma-ketlik ma'lumotlarini kompleks tahlil qilish". Saraton haqida informatika. 13 (Qo'shimcha 2): 49-53. doi:10.4137 / CIN.S13783. PMC  4179644. PMID  25288879.
  7. ^ Korbel, JO; Urban, AE; Affourtit, JP; Godvin, B; Grubert, F; Simons, JF; Kim, Bosh vazir; Palejev, D; Carriero, NJ; Du, L; Taillon, BE; Chen, Z; Tanzer, A; Saunders, AC; Chi, J; Yang, F; Karter, NP; Hurles, ME; Vaysman, SM; Xarkins, TT; Gershteyn, MB; Egholm, M; Snayder, M (2007 yil 19 oktyabr). "Juft xarita xaritasi inson genomidagi keng tarkibiy o'zgarishni aniqlaydi". Ilm-fan. 318 (5849): 420–6. Bibcode:2007Sci ... 318..420K. doi:10.1126 / science.1149504. PMC  2674581. PMID  17901297.
  8. ^ Chjao, Min; Vang, Tsinguo; Vang, Quan; Jia, Peilin; Zhao, Zhongming (2013). "Keyingi avlod ketma-ketligi ma'lumotlari yordamida nusxa ko'chirish raqamlari o'zgarishini (CNV) aniqlash uchun hisoblash vositalari: xususiyatlari va istiqbollari". BMC Bioinformatika. 14 (Qo'shimcha 11): S1. doi:10.1186 / 1471-2105-14-S11-S1. PMC  3846878. PMID  24564169.
  9. ^ Korbel, J. O .; Urban, A. E.; Affourtit, J. P .; Godvin, B .; Grubert, F.; Simons, J. F .; Kim, P. M.; Palejev, D .; Carriero, N. J .; Du, L .; Taillon, B. E .; Chen, Z .; Tanzer, A .; Sonders, A. C. E .; Chi, J .; Yang, F.; Karter, N. P.; Xerles, M. E .; Vaysman, S. M.; Xarkins, T. T .; Gershteyn, M. B .; Egholm, M .; Snayder, M. (2007 yil 19 oktyabr). "Ikkilangan xaritalash inson genomidagi keng tarkibiy o'zgarishni ochib beradi". Ilm-fan. 318 (5849): 420–426. Bibcode:2007Sci ... 318..420K. doi:10.1126 / science.1149504. PMC  2674581. PMID  17901297.
  10. ^ Chjou, Xong-Vey; Li, Dong-Fang; Tam, Nora Fung-Yi; Tszyan, Syao-Tao; Chjan, Xay; Sheng, Xua-Fang; Tsin, Jin; Lyu, Syao; Zou, Fey (2010 yil 21 oktyabr). "BIPES, mikroblarning xilma-xilligini baholashning iqtisodiy samaradorligi yuqori samaradorlik usuli". ISME jurnali. 5 (4): 741–749. doi:10.1038 / ismej.2010.160. PMC  3105743. PMID  20962877.

Shuningdek qarang