O'zgartirilmagan oqsillarni fotosurat bilan o'zaro bog'liqligi - Photo-induced cross-linking of unmodified proteins

O'zgartirilmagan oqsillarni o'zaro bog'liqligi (PICUP) fotokatalizatorni elektron akseptori va qiziqadigan oqsil ishtirokida ko'rinadigan yorug'lik nurlanishi bilan oqsillarni o'zaro bog'lash usuli hisoblanadi.[1] Nurlanish natijasida bog'lanadigan oqsillarning aminokislota yon zanjirlari o'rtasida kovalent bog'lanish hosil qiluvchi yuqori reaktiv oqsil radikallari paydo bo'ladi. O'zaro bog'lanish usullari PICUPdan oldin ishlab chiqilgan, shu jumladan fizik, oksidlovchi va kimyoviy o'zaro bog'lovchilarni qo'llash, ko'proq vaqt talab qiladi va natijada oqsilning yon mahsulotlariga olib keladi.[2] Bundan tashqari, o'zaro bog'liq bo'lgan reaktivlarning ko'p funktsionalligi tufayli o'zaro bog'liq protein hosilasi juda past.

Jarayon birinchi marta 1999 yilda polipeptidlarning o'zaro ta'sirini tahlil qilish uchun oqsillarni o'zaro bog'lash usullaridan va shuningdek, oqsillarning strukturaviy farqlaridan foydalanish uchun qo'llanilgan. katalitik yo'l. 20-asrdagi texnikalar yuqori rentabellikda ushbu oqsillarning tez va vaqtincha o'zgarishini o'zaro bog'lash uchun qo'llanilishi uchun etarli emas edi. PICUP bir-biriga yaqin joyda kovalent bog'langan oqsillarni tez (<1 soniya) va yuqori ishlab chiqarishga imkon berdi.[2]

Tarix

Fancy va Kodadek

1999 yilda Fancy va Kodadek tomonidan PICUP qo'llanilishi birinchi marta oqsillarni o'zaro bog'lanishini shu qadar qisqa vaqt ichida (1 soniya) va ko'rib chiqilayotgan oqsillarning tuzilishini o'zgartirmasdan amalga oshirish mumkin edi.[2] Bundan tashqari, PICUP fiziologik pH 7,4 darajasida bajarilishi mumkin edi, bu oqsillarni o'zaro bog'liqligini yanada oshirish uchun eshiklarni ochdi, masalan, inson tanasida oqsillar ishtirok etadigan biokimyoviy mexanizmlarni o'rganish. Bundan tashqari, tomonidan nurlanish ko'rinadigan yorug'lik PICUP-da foydalidir, chunki tahlil qilinadigan metabolik yo'llarda ishtirok etadigan ko'plab biomolekulalar to'lqin uzunliklari oralig'idan past nurni yutmaydi. UV nurlari, denaturatsiyasiz o'zaro bog'liqliklarga imkon beradi.[2]

Bitan, Lomakin va Teplou

2001 yilda Gal Bitan, Aleksey Lomakin va Devid B. Teplov PICUP dasturini o'qishga topshirdilar amiloid b-oqsil (Aβ) Altsgeymer kasalligida kuzatiladigan oligomerizatsiya.[3] PICUP tezkor o'zaro bog'liqlik qobiliyati tufayli metabast bo'lgan Aable oligomerlarini aniqlash va miqdorini aniqlashga imkon berdi.[3] PICUP bilan birlashma natriy dodesil sulfat poliakrilamidli gel elektroforez (SDS-PAGE), oligomerlarning tez muvozanatda taqsimlanishi miqdoriy aniqlandi.[3] Ushbu dastur neyrodejenerativ kasalliklar bilan bog'liq amiloidogen oqsillarni o'rganishga imkon berdi va kelajakda mumkin bo'lgan terapevtik mexanizmlar uchun eshiklarni ochdi. Neyrodejenerativ kasalliklar hozirgi vaqtda neyrotoksik oqsillarning natijasi deb taxmin qilinmoqda, shuning uchun ularning oligomer tarqalishini o'rganish qobiliyati bu oligomerlarning qanday va qanday sharoitda hosil bo'lishini tushunishda samarali bo'ladi.

Mexanizm

APS va Ru (Bpy)3 hayajonlangan Ru (Bpy) hosil qilish reaktsiyasi3

PICUP mexanizmi quyidagilarni talab qiladi tris (bipiridil) Ru (II) kompleksi, elektron akseptor, ammoniy persulfat (APS) va reaktiv aminokislotalarning yon zanjirlari.[2] Tris (2,2′-bipiridil) diklororuteniy (II) geksahidrat, tris (bipiridil) Ru (II) kompleksi, dastlab Ru ni o'z ichiga oladi2+.[4] Ko'rinadigan nurli nurlanishda va ammoniy persulfat (APS) mavjud bo'lganda, Ru2+ uning hayajonlangan holatiga kiradi va Ru ga oksidlanadi3+.[4] Ru3+ endi nihoyatda reaktiv oksidlovchi bo'lib, u standart ikkitasi o'rniga faqat bitta elektronni qabul qilmoqchi.[4] Reaksiya elektron akseptori bo'lmagan holda davom etishi mumkin, ammo u ancha past samaradorlikka ega bo'lib, hayajonlangan Ru (Bpy) natijasida hosil bo'lgan yon mahsulotlarni hosil qiladi.3 kislorod bilan reaksiyaga kirishish.[5] Samarali yagona elektron oksidlovchi sifatida Ru3+ qo'shni oqsillarning aminokislotalaridan bitta elektronni oladi, ko'pincha Triptofan va Tirozin.[4] Bu ishlab chiqaradi radikal aminokislotalar yon zanjirlarida bu juda beqaror bo'lib, reaksiyalar natijasida yanada barqaror holatga keladi.

Aminokislotali yon zanjirlar (kyrozin) o'rtasida kovalent bog'lanish hosil bo'lishi

Yon zanjirdagi juftlanmagan bitta elektron yaqin atrofdagi polipeptidning boshqa aminokislota yon zanjiri bilan reaksiyaga kirishadi, natijada kovalent bog'lanish bilan dimer hosil bo'ladi.[4] Ru ning tiklanishi bilan2+ qachon Ru3+ aminokislotalardan elektronni olganda Ru bilan doimiy ravishda radikallar hosil bo'lishiga imkon beradi3+ APS tomonidan oksidlanib[2]

Reaktsiya sodir bo'lgan PCR naychasida ko'plab beqaror oqsil radikallari oddiy diffuziya orqali bir-biri bilan aloqa qilishadi va barqarorroq holatga erishish uchun ichki va molekulalararo reaksiyaga kirishadilar. Monomerik oqsil radikallari dimer hosil qilish va vodorod atomini ajratib olish uchun kovalent bog hosil qilish orqali past energiya holatiga erishishga qodir.[4] E'tibor bering: Rasmda protonning chiqarilishi xatolik bilan ko'rsatilgan va uni bu shaklda ishlatmaslik kerak (Shuningdek, 4-bandga qarang). Ijodkor bilan bog'lanishdi. Ushbu yangi hosil bo'lgan dimer, xuddi shu mexanizm orqali ko'plab boshqa monomerlar yoki dimerlar bilan reaksiyaga kirishib, o'zaro bog'liq bo'lgan oligomerlarning ko'proq sonini yaratishga qodir.[4] Bu aralashmada turli xil oligomerlarning tarqalishini ta'minlaydi.

Usul

Protein aralashmasini nurlantirish uchun ishlatiladigan kamera apparatlari

Har bir tajribada, oqsillarni o'zaro bog'lash tajribasida ishlatiladigan oqsil, ammoniy persulfat va Tris (2,2′-bipiridil) diklororutenium (II) heksahidratning nisbiy konsentratsiyasini aniqlash muhim ahamiyatga ega. Oldingi tajribalar shuni ko'rsatdiki, uchun amiloid b-oqsil (Aβ), peptid zaharlanishni keltirib chiqaradi Altsgeymer kasalligi, oqsilning nisbati: Ru (Bpy)3: APS - 1: 2: 40.[3] Ru (Bpy) nisbati3 va APS ni ushbu nisbatda saqlash tavsiya etiladi, ammo ma'lum bir oqsilning tegishli konsentratsiyasi o'zgarishi mumkin. PICUP hali ishlatilmagan ko'plab oqsillar uchun tegishli konsentratsiyalarni topish sinov va xatolar orqali amalga oshirilishi mumkin. Odatda, oqsil kontsentratsiyasi, ehtimol, mos keladigan tamponda erigan holda 10 dan 50 mkM gacha tushadi natriy fosfat agar fiziologik pH darajasida sharoitlar bo'yicha sinov o'tkazilsa. Biroq, sof oqsilni ba'zi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, Ru (Bpy)3 nisbat ham 1: 2 darajasida saqlanishi kerak.[4] Ushbu daraja Ru (Bpy) ning eng past miqdori3 oqsil namunasi yuqori darajadagi oligomerlarning haqiqiy sonidan ko'prog'iga va Ru (Bpy) ning ko'proq miqdoriga olib kelishi mumkin.3 yon mahsulotlarni sun'iy ravishda o'zaro bog'lashga imkon berishi mumkin.

PICUP uchun umumiy usul quyidagicha:

  1. Tegishli miqdordagi oqsil miqdori pipetka bilan polimeraza zanjiri reaktsiyasi naychasiga (PCR) quyiladi.[6]
  2. Ammoniy persulfat (APS) va Tris (2,2′-bipiridil) diklororutenium (II) geksahidrat namunaga qo'shiladi va qisqa aralashtiriladi.[6]
  3. PCR naychasi shisha flakonga joylashtirilgan bo'lib, uni aralashmani nurlantiradigan kameraning körükleri ichida ushlab turish kerak. Kamerani yopadigan qopqoqni yopgandan so'ng, kameraning qopqog'ini bosish naychani yoritadi, qancha vaqt nurlanishini ta'minlasangiz. Tajribaning har bir nusxasi uchun bir xil kameradan foydalanish har bir PICUP tajribasi uchun nurlanish vaqti va yorug'lik manbasidan masofa boshqarilishini ta'minlaydi.[6]
  4. PCR naychasidagi namunani nurlantirgandan so'ng, hisoblangan miqdori 1M Dithiothreitol (DTT) reaksiyani so'ndirish uchun darhol aralashga qo'shiladi. Agar reaksiya o'chirilmasa, oligomerlar doimiy ravishda birlashadi va quyi tartibli oligomerlar aralashmada bo'lmaydi. Bundan tashqari, agar SDS-PAGE PICUP dan keyin oqsillarning oligomer tarqalishini tahlil qilish uchun ishlatilishi kerak, DTT ham gel elektroforezidan oldin oqsillarni denatura qiluvchi vosita sifatida ishlaydi.[6]

Ilovalar

PICUP-ni oqsil komplekslarida ishlatish ushbu oqsillar haqida katalitik va kinetik ma'lumotlarni taqdim etishda foydalidir, chunki katalitik mexanizmlar tezkor va PICUP oqsillarni tez va yuqori samarali o'zaro bog'lash imkonini beradi.[5] Biroz epitop va yaqinlik teglari o'zaro bog'langan oqsillarni vizualizatsiyalashga imkon beradigan PICUP reaktsiyasidan ta'sirlanmaganligi ko'rsatilgan.[5]

Bundan tashqari, PICUP oqsilni oligomer tarqalishining miqdoriy tasmalarini, uni oqsillarni fraktsiyalash texnikasi bilan birlashganda, ingl. Ushbu birikma, ayniqsa, neyrodejenerativ kasalliklarning oligomerlarini tekshirishda foydalidir Altsgeymer kasalligi, Parkinson kasalligi va Xantington kasalligi, bu oqsillarni to'planishidan kelib chiqadi.[1] PICUP ushbu kasalliklarning oldini olish va davolash tartiblarini o'rganishda juda muhimdir, chunki tegishli kasallikning agregatsiyaga moyilligini tekshirish kerak. amiloidogen oqsillar.

Shuningdek qarang

Adabiyotlar

  1. ^ a b Rahimi, Farid; Mayti, Panchanan; Bitan, Gal (2009-01-12). "Amiloidogen peptidlarga qo'llaniladigan modifikatsiyalanmagan oqsillarni (PICUP) o'zaro bog'liqligi". Vizual eksperimentlar jurnali (23). doi:10.3791/1071. ISSN  1940-087X. PMC  2763294. PMID  19229175.
  2. ^ a b v d e f Fancy, Devid A.; Kodadek, Tomas (1999-05-25). "Oqsil-oqsilning o'zaro ta'sirini tahlil qilish kimyosi: uzoq to'lqin uzunligidagi yorug'lik tez va samarali o'zaro bog'liqlik". Amerika Qo'shma Shtatlari Milliy Fanlar Akademiyasi materiallari. 96 (11): 6020–6024. Bibcode:1999 yil PNAS ... 96.6020F. doi:10.1073 / pnas.96.11.6020. ISSN  0027-8424. PMC  26828. PMID  10339534.
  3. ^ a b v d Bitan, Gal; Lomakin, Aleksey; Teplou, Devid B. (2001-09-14). "Amiloid b-oqsillar oligomerizatsiyasi. O'zgartirilmagan oqsillarni fotosuratlar bilan bog'lash orqali ishlab chiqarilgan o'zaro ta'sirlar". Biologik kimyo jurnali. 276 (37): 35176–35184. doi:10.1074 / jbc.M102223200. ISSN  0021-9258. PMID  11441003.
  4. ^ a b v d e f g h Bitan, Gal (2006). "Metastabil amiloidogen oqsil oligomerlarini fotosurat bo'yicha strukturaviy o'rganish - O'zgartirilgan oqsillarni o'zaro bog'liqligi va bog'lanishi". Modifikatsiyalanmagan oqsillarni fotosurat bilan o'zaro bog'lash orqali metastabil amiloidogen oqsil oligomerlarini tarkibiy o'rganish.. Enzimologiyadagi usullar. 413. 217–236 betlar. doi:10.1016 / S0076-6879 (06) 13012-8. ISBN  9780121828189. ISSN  0076-6879. PMC  2782599. PMID  17046399.
  5. ^ a b v Fancy, D. A .; Denison, C .; Kim, K .; Xie, Y .; Holdeman, T .; Amini, F.; Kodadek, T. (sentyabr 2000). "Oqsillarni suvda eruvchan metall komplekslari bilan o'zaro bog'lanishining fotosurat ta'sir doirasi, cheklovlari va mexanik jihatlari". Kimyo va biologiya. 7 (9): 697–708. doi:10.1016 / s1074-5521 (00) 00020-x. ISSN  1074-5521. PMID  10980450.
  6. ^ a b v d Vollers, Sabrina S.; Teplou, Devid B.; Bitan, Gal (2004). Amiloid oqsillari. Molekulyar biologiya usullari. 299. 011-018 betlar. doi:10.1385/1-59259-874-9:011. ISBN  978-1-59259-874-8. PMID  15980592.