Rekombinering - Recombineering

Rekombinering (recombimillat vositachiligidagi genetik ingineering)[1] genetik va molekulyar biologiya asoslangan texnika gomologik rekombinatsiya eski / keng tarqalgan foydalanish usulidan farqli o'laroq tizimlar cheklash fermentlari va ligazlar DNK ketma-ketliklarini belgilangan tartibda birlashtirish. Rekombinerlash bakterial genetika uchun, shartli qilish uchun maqsadli vektorlarni yaratishda keng qo'llaniladi sichqonchani nokaut qilish va ko'pincha a tarkibidagi har qanday manbaning DNKini o'zgartirish uchun bakterial sun'iy xromosoma (BAC), boshqa dasturlar qatorida.

Rivojlanish

Garchi bakteriyalarda rivojlangan bo'lsa-da, rekombinerlash texnikasi uchun ilhomning ko'p qismi birinchi bo'lib ishlab chiqilgan usullardan kelib chiqqan Saccharomyces cerevisiae [2] bu erda chiziqli plazmid xromosomadagi genlarni yoki genlarni klonlash uchun ishlatilgan. Bundan tashqari, bitta ip bilan rekombinatsiya oligonukleotidlar (oligos) birinchi bo'lib ko'rsatilgan Saccharomyces cerevisiae.[3] Rekombinatsiya 20 tagacha qisqa bo'lgan oligonukleotidlar bilan sodir bo'lganligi kuzatildi.

Rekombineering in gomologik rekombinatsiyaga asoslangan Escherichia coli vositachilik qiladi bakteriyofag oqsillar, yoki Rac prophage dan RecE / RecT [4] yoki Redaβδ dan bakteriofag lambda.[5][6] Lambda Qizil rekombinatsiya tizimi hozirda eng ko'p ishlatiladi va Qizilning birinchi namoyishlari jonli ravishda genetik muhandislik mustaqil ravishda Kenan Merfi tomonidan qilingan[7] va Frensis Styuart.[4][5] Shu bilan birga, Merfi tajribalari RecA-ni ifodalashni talab qildi va uzoq homologik qo'llarni ham ishlatdi. Binobarin, yangi DNK muhandislik texnologiyasining ta'siri aniq emas edi. Styuart laboratoriyasi shuni ko'rsatdiki, ushbu gomologik rekombinatsiya tizimlari homologik ketma-ketliklar bilan yonma-yon joylashgan chiziqli DNK molekulalarining maqsadga muvofiq rekombinatsiyasida vositachilik qiladi. DNK RecA yo'qligida ketma-ketliklar. Endi homologiyani buyurtma asosida va oligonukleotidlar bilan ta'minlash mumkin edi recA klonlash xostlaridan foydalanish mumkin edi, bu esa rekombinerizatsiya dasturini ancha kengaytirdi.

DsDNA bilan rekombinerizatsiya

Rekombinerlash DNK-ning ikki qatlamli (dsDNA) yoki bitta zanjirli (ssDNA) chiziqli substratlaridan foydalanadi. Odatda, dsDNA rekombineri genlarni almashtirish, yo'q qilish, qo'shimchalar va inversiyalarni yaratish uchun ishlatilgan. Genlarni klonlash[6][8] va genlarni / oqsillarni etiketlash (Uning teglari va boshqalarni ko'ring.) [9]) ham keng tarqalgan. Genlarni almashtirish yoki yo'q qilish uchun odatda giyohvandlikka chidamli genni kodlovchi kasseta PCR tomonidan ikki qismli primerlardan foydalangan holda tayyorlanadi. Ushbu primerlar (5 '→ 3' dan) maqsadli mintaqaga 50 ta homologiyaning asoslaridan iborat bo'lib, u erda kasseta joylashtirilishi kerak, so'ngra 20 ta asosga dori-darmonlarga chidamli kassetani tayyorlash uchun. Oxirgi konstruktsiyaning aniq birlashma ketma-ketligi primer dizayni bilan aniqlanadi.[10][11] Ushbu hodisalar odatda taxminan 10 chastotada sodir bo'ladi4/108tirik qolgan hujayralar elektroporatsiya. Elektroporatsiya - bu chiziqli substratni rekombinatsiya qiluvchi hujayraga aylantirish uchun ishlatiladigan usul.

Tanlash / qarshi hisoblash texnikasi

Ba'zi hollarda, biron bir belgi qolmagan holda o'chirishni, genlar sintezini yoki genda nuqta mutantini qilishni xohlaydi. Buni ikki tur rekombinatsiya yordamida amalga oshirish mumkin.[12] Rekombinerlashning birinchi bosqichida modifikatsiya qilinadigan mintaqani almashtirish uchun kassetadagi tanlov markeri kiritiladi. Ikkinchi bosqichda kerakli modifikatsiyani o'z ichiga olgan nishon fragmenti kiritilgandan so'ng kassetadagi ikkinchi qarshi tanlov markeri (masalan, sacB) tanlanadi. Shu bilan bir qatorda, maqsad bo'lagi yon tomonda bo'lishi mumkin loxP yoki FRT saytlari, ularni keyinchalik ifodasi bilan olib tashlash mumkin edi Cre yoki mos ravishda FLP rekombinazlari. Rekombinering samaradorligini oshirish uchun yangi tanlov markeri "mFabI" ham ishlab chiqilgan.[13]

SSDNA bilan rekombinerizatsiya

SsDNA bilan rekombineratsiya reaksiya samaradorligida ham, nuqta mutatsiyalarini yaratish qulayligida ham katta yutuqlarni ta'minladi.[1] Ushbu uslub metilga yo'naltirilgan nomuvofiqlikni tuzatish tizimidan qochib, rekombinantlarni olish chastotasini 10 dan oshirishi mumkinligini kashf qilish bilan yanada yaxshilandi.7/108 hayotiy hujayralar.[14] Ushbu chastota etarlicha yuqori, endi o'zgarishlarni tanlanmasdan amalga oshirish mumkin. Optimallashtirilgan protokollar yordamida elektroporatsiyadan omon qolgan hujayralarning 50% dan ortig'i kerakli o'zgarishni o'z ichiga oladi. SsDNA bilan rekombinatsiyalash uchun faqat Red Beta oqsillari kerak; Exo, Gamma va xost rekombinatsiyasi oqsillari talab qilinmaydi. Beta va RecT ga homolog oqsillar ko'plab bakteriya va bakteriofaglarda (2010 yil fevral holatiga ko'ra> 100) topilganligi sababli, rekombinerlanish turli xil bakteriyalarda ishlashi mumkin.[15] Shunday qilib, ssDNA bilan rekombinatsiya turli xil organizmlarda tadqiqotlar uchun mavjud bo'lgan genetik vositalarni kengaytirmoqda. Bugungi kunga kelib rekombinerizatsiya amalga oshirildi E. coli, S. enterica, Psevdotuberkulyoz, S. cerevisiae va M. sil kasalligi.[16][17][18][19][20][21]

Qizil-mustaqil rekombinatsiya

2010 yilda ma'lum rekombinatsiya funktsiyalari bo'lmagan taqdirda ssDNA rekombinatsiyasi sodir bo'lishi mumkinligi isbotlangan.[22] Rekombinantlar 10 ga qadar topilgan4/108 hayotiy hujayralar. Ushbu Qizildan mustaqil faoliyat namoyish etildi P. syringae, E. coli, S. enterica serovar typhimurium va S. flexneria.

Rekombineratsiyaning qo'llanilishi va afzalliklari

Rekombinerlashning eng katta afzalligi shundaki, u qulay joylashishga bo'lgan ehtiyojni yo'q qiladi cheklash saytlari, an'anaviy genetik muhandislikda DNK modifikatsiyasi ko'pincha noyob taqiqlash joylari mavjudligi bilan buziladi. Muhandislikda> 100 kb bo'lgan katta konstruktsiyalar, masalan Bakterial sun'iy xromosomalar (BAC) yoki xromosomalar, rekombinerizatsiya zarurat bo'lib qoldi. Rekombineering hech qanday "iz" qoldirmasdan kerakli modifikatsiyani yaratishi mumkin. Bundan tashqari, bir nechta narsa bekor qilinadi klonlash oraliq hosil qilish bosqichlari vektorlar va shuning uchun nisbatan qisqa vaqt ichida DNK konstruktsiyalarini o'zgartirish uchun foydalaniladi. Kerakli gomologiya etarlicha qisqa, chunki u sintetik oligonukleotidlarda hosil bo'lishi mumkin va qisqa oligonukleotidlar bilan rekombinatsiya qilish juda samarali. Yaqinda rekombinering "rekombinatorlik quvurlari" deb nomlangan yuqori quvvatli DNK muhandislik dasturlari uchun ishlab chiqilgan.[23] Rekombinatsion quvurlar BACning yirik hajmdagi ishlab chiqarilishini qo'llab-quvvatlaydi transgenlar va genlarni yo'naltirish EUCOMM (European Condition Mouse Mutagenesis Consortium) va KOMP (Knock-Out Mouse Program) kabi funktsional genomika dasturlari uchun tuzilmalar. Rekombinering ham avtomatlashtirildi, bu jarayon cherkov laboratoriyasida "MAGE" -Multiplex avtomatlashtirilgan genom muhandisligi deb nomlandi.[24] CRISPR texnologiyalari rivojlanishi bilan CRISPR aralashuvi shtammlar E. coli gen ekspressionini boshqarish uchun oddiy va oson amalga oshiriladigan vositani ta'minlaydigan, faqat bir bosqichli oligo rekombinerizatsiyasini talab qiladi.[12][25]Shuningdek, bir qator o'simlik turlari uchun "rekombinatsiya vositalari" va laboratoriya protokollari tatbiq etildi. Ushbu vositalar va protseduralar barcha tadqiqotchilar uchun moslashtirilgan, kengaytiriladigan va erkin foydalanish imkoniyatiga ega. [26]

Adabiyotlar

  1. ^ a b Ellis H. M., Yu D., DiTizio T., Sud D. L. (2001). "Bir qatorli oligonukleotidlar yordamida xromosoma DNKning yuqori samaradorlikdagi mutagenezi, ta'mirlanishi va muhandisligi". Milliy fanlar akademiyasi materiallari. 98 (12): 6742–6746. Bibcode:2001 yil PNAS ... 98.6742E. doi:10.1073 / pnas.121164898. PMC  34423. PMID  11381128.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  2. ^ Orr-Uayver, T. L., J. V. Szostak va boshqalar. (1983) Lineer va bo'shliqli plazmidlar bilan xamirturush transformatsiyasining genetik qo'llanilishi. Usullari. Ferment. 101: 228-245.
  3. ^ Moerschell R. P., Tsunasawa S.; va boshq. (1988). "Xamirturushni sintetik oligonukleotidlar bilan almashtirish". Milliy fanlar akademiyasi materiallari. 85 (2): 524–528. Bibcode:1988 yil PNAS ... 85..524M. doi:10.1073 / pnas.85.2.524. PMC  279583. PMID  2829192.
  4. ^ a b Zhang Y., Buchholz F., Muyrers J. P., Stewart A. F. (1998). "Escherichia coli-da rekombinatsiyadan foydalangan holda DNK muhandisligi uchun yangi mantiq". Tabiat genetikasi. 20 (2): 123–128. doi:10.1038/2417. PMID  9771703.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  5. ^ a b Muyrers J. P., Zhang Y., Testa G., Stewart A. F. (1999). "ET-rekombinatsiya orqali bakterial sun'iy xromosomalarning tezkor modifikatsiyasi". Nuklein kislotalarni tadqiq qilish. 27 (6): 1555–1557. doi:10.1093 / nar / 27.6.1555. PMC  148353. PMID  10037821.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  6. ^ a b Yu D., Ellis H. M.; va boshq. (2000). "Escherichia coli-da xromosoma muhandisligi uchun samarali rekombinatsiya tizimi". Milliy fanlar akademiyasi materiallari. 97 (11): 5978–5983. Bibcode:2000PNAS ... 97.5978Y. doi:10.1073 / pnas.100127597. PMC  18544. PMID  10811905.
  7. ^ Murphy K. C. (1998). "Escherichia coli-da genlarni almashtirishni rag'batlantirish uchun bakteriofag-rekombinatsiya funktsiyalaridan foydalanish". Bakteriologiya jurnali. 180 (8): 2063–2071. doi:10.1128 / JB.180.8.2063-2071.1998. PMC  107131. PMID  9555887.
  8. ^ Zhang, Y., Muyrers, JP.P., Testa, G. va Styuart, AF (2000) Escherichia coli-da homolog rekombinatsiya orqali DNKni klonlash Tabiat biotexnologiyasi 18, 1314 - 1317
  9. ^ Poser I, Sarov M, Xutchins JR, Heriche JK, Toyoda Y, Pozniakovskiy A, Vaygl D, Nitsshe A, Hegemann B, Bird AW, Pelletier L, Kittler R, Xua S, Naumann R, Augsburg M, Sykora MM, Xofemeister H , Zhang Y, Nasmyth K, White KP, Dietzel S, Mechtler K, Durbin R, Stewart AF, Peters JM, Buchholz F, Hyman AA (2008). "BAC TransgeneOmics: sutemizuvchilarda oqsil funktsiyasini o'rganish uchun yuqori samaradorlik usuli". Tabiat usullari. 5 (5): 409–15. doi:10.1038 / nmeth.1199. PMC  2871289. PMID  18391959.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  10. ^ Savitske J. A., Thomason LC, Kostantino N., Bubunenko M., Datta S., Sud D. L. (2007). "Rekombinering: in vivo jonli genetik muhandislik E. coli, S. enterica va boshqa joylarda". Ilg'or bakteriyalar genetikasi: Genomik muhandislik uchun transpozonlar va fajlardan foydalanish. Enzimologiyadagi usullar. 421. 171-199 betlar. doi:10.1016 / S0076-6879 (06) 21015-2. ISBN  9780123737496. PMID  17352923.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  11. ^ Thomason, L., D. L. Court, M. Bubunenko, N. Kostantino, H. Uilson, S. Datta va A. Oppenxaym, (2007) Rekombinering: Gomologik rekombinatsiyadan foydalangan holda bakteriyalarda genetik muhandislik. In: Amaldagi protokollar Molekulyar biologiyada. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, Inc., bet.1-qism 16-bet. 11-24.
  12. ^ a b Li, X; Tomason, LC; Savitske, JA; Kostantino, N; Court, DL (2013). "TetA-sacB kassetasidan foydalangan holda ijobiy va salbiy tanlov: Escherichia coli-da rekombinatsiya va P1 o'tkazuvchanligi". Nuklein kislotalarni tadqiq qilish. 41 (22): e204. doi:10.1093 / nar / gkt1075. PMC  3905872. PMID  24203710.
  13. ^ E. coli-da DNKni samarali klonlash va rekombinerizatsiya qilish uchun yangi tanlov markeri
  14. ^ Kostantino N., sud D. L. (2003). "Mutanosib mutanosiblikdagi qizil mediatsiyali rekombinantlarning yuqori darajalari". Amerika Qo'shma Shtatlari Milliy Fanlar Akademiyasi materiallari. 100 (26): 15748–15753. Bibcode:2003 PNAS..10015748C. doi:10.1073 / pnas.2434959100. PMC  307639. PMID  14673109.
  15. ^ Datta S., Kostantino N., Chjou X., Sud D. L. (2008). "Gram-manfiy va gram-musbat bakteriyalar va ularning faglaridan rekombinatura funktsiyalarini aniqlash va tahlil qilish". Milliy fanlar akademiyasi materiallari. 105 (5): 1626–1631. Bibcode:2008 yil PNAS..105.1626D. doi:10.1073 / pnas.0709089105. PMC  2234195. PMID  18230724.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  16. ^ Derbise, A., B. Lesic, D. Dacheux, J. M. Gigo & E. Carniel, (2003) Yersiniyadagi xromosoma genlarini inaktivatsiya qilishning tezkor va sodda usuli. FEMS Immunol. Med. Mikrobiol. 38: 113-116.
  17. ^ van Kessel J. C., Hatfull G. F. (2007). "Tuberkulyoz mikobakteriyasida rekombinatsiya". Tabiat usullari. 4 (2): 147–152. doi:10.1038 / nmeth996. PMID  17179933.
  18. ^ van Kessel J. C., Hatfull G. F. (2008). "Mikobakterial rekombinerizatsiya". Mikobakteriyalar protokollari. Molekulyar biologiya usullari. 435. 203-215 betlar. doi:10.1007/978-1-4939-2450-9_10. ISBN  978-1-4939-2449-3. PMID  25779316.
  19. ^ van Kessel J. C., Hatfull G. F. (2008). "Bir qatorli DNK rekombinatsiyasi yordamida mikobakteriyalarda samarali nuqta mutagenezi: antimikobakterial dori maqsadlarini tavsiflash". Molekulyar mikrobiologiya. 67 (5): 1094–1107. doi:10.1111 / j.1365-2958.2008.06109.x. PMID  18221264.
  20. ^ van Kessel J. C., Marinelli L. J., Hatfull G. F. (2008). "Rekombinerlovchi mikobakteriyalar va ularning fajlari". Tabiat sharhlari Mikrobiologiya. 6 (11): 851–857. doi:10.1038 / nrmicro2014. PMC  3503148. PMID  18923412.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  21. ^ DiKarlo Jeyms E., Konli Endryu J., Penttilya Merja, Yantti Jussi, Vang Xarris H., Cherkov Jorj M. (2013). "Xamirturushli Oligo vositachiligida Genom muhandisligi (YOGE)". ACS Sintetik Biologiya. 2 (12): 741–749. doi:10.1021 / sb400117c. PMC  4048964. PMID  24160921.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  22. ^ Swingle B., Markel E., Costantino N., Bubunenko M. G., Cartinhour S., Court D. L. (2010). "Gram-manfiy bakteriyalardagi oligonukleotid rekombinatsiyasi". Molekulyar mikrobiologiya. 75 (1): 138–148. doi:10.1111 / j.1365-2958.2009.06976.x. PMC  3404488. PMID  19943907.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  23. ^ Sarov M., Shnayder S., Pozniakovski A., Roguev A., Ernst S., Zhang Y., Hyman A. A., Styuart A. F. (2006). "Caenorhabditis elegans-ga qo'llaniladigan funktsional genomika uchun rekombinatorlik quvuri". Tabiat usullari. 3 (10): 839–844. doi:10.1038 / nmeth933. PMID  16990816.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  24. ^ Vang H.H., Isaaks F. J., Karr PA, Sun ZZ, Xu G., Forest CR, Cherkov G.M. (2009). "Genomlarning multipleksli muhandisligi va tezlashtirilgan evolyutsiyasi orqali hujayralarni dasturlash". Tabiat. 460 (7257): 894–898. Bibcode:2009 yil natur.460..894W. doi:10.1038 / nature08187. PMC  4590770. PMID  19633652.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  25. ^ Li, X; Iyun, Y; Erikstad, M; Jigarrang, S; Parklar, A; Sud, D; Iyun, S (2016). "tCRISPRi: sozlanishi va qaytarilishi mumkin, gen ekspressionini bir bosqichli boshqarish". Ilmiy ma'ruzalar. 6: 39096. Bibcode:2016 yil NatSR ... 639076L. doi:10.1038 / srep39076. PMC  5171832. PMID  27996021.
  26. ^ Brumos J, Zhao C, Gong Y, Soriano D, Patel AP, Perez-Amador MA, Stepanova AN, Alonso JM (2019). "O'simliklar uchun takomillashtirilgan rekombinatlash vositasi". O'simlik hujayrasi. 32: tpc.00431.2019. doi:10.1105 / tpc.19.00431. PMC  6961616. PMID  31666295.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)

Tashqi havolalar

  • redrecombineering.ncifcrf.gov - Rekombinerizatsiya haqida batafsil ma'lumotlar, shuningdek protokollar, tez-tez so'raladigan savollar va rekombinerizatsiya uchun zarur bo'lgan shtammlar va plazmidlarni so'rash uchun foydalanish mumkin.